Bertolfo era uno dei numerosi parenti di S. Arnolfo di Metz (18 lug.) venerato come santo. Cresciuto come pagano, rimase talmente colpito dagli insegnamenti e dall'esempio di Arnolfo che si convertì.
Nel 620 divenne monaco a Luxeuil, dove rimase per alcuni anni, imparando la disciplina di S. Colombano (23 nov.) dal suo successore S. Eustace. S. Attala (10 mar.), che era succeduto a S. Colombano come abate di Bobbio, si interessò a lui e Bertolfo ottenne il permesso di trasferirsi nel monastero. Alla morte di Attala, nel 627, fu eletto abate. Si dimostrò un superiore santo e illuminato, fedele all'austera Regola di S. Colombano. Al di fuori del monastero Bertolfo si oppose fermamente all'arianesimo che si stava diffondendo nell'Italia del nord.
L'anno seguente la nomina di Bertolfo, il vescovo Probo di Tortona rivendicò la giurisdizione sul monastero. Bertolfo si appellò ad Ariovaldo, re dei longobardi, che decise che il problema doveva essere presentato a Roma e pagò il viaggio all'abate perché vi si recasse. Bertolfo prese con sé come segretario il monaco long (che in seguito scrisse la Vita di Bertolfo).
Papa Onorio I conosceva la buona reputazione del monastero e gli concesse l'immunità dalla giurisdizione vescovile. Questa decisione, la prima nel suo genere, pare abbia iniziato una nuova era nei rapporti tra il clero regolare e i vescovi. Tona dice che durante il viaggio di ritorno Bertolfo fu stroncato dalla febbre. Pareva stesse per morire, ma la vigilia dei SS. Pietro e Paolo cadde in un sonno profondo, durante il quale ebbe una visione di S. Pietro. Al risveglio si era quasi completamente rimesso.
MARTIROLOGIO ROMANO. Nel monastero di Bobbio in Emilia, san Bertolfo, abate, successore di sant’Attala nello stesso cenobio.
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